2. INTRODUCCIÓN

1.- Elección del gen
El gen que hemos elegido para realizar el análisis bioinformático se denomina "apa,modD,Rv1860,MT1908,MTCY359.13". La elección del gen la hemos realizado a partir del siguiente enlace: http://bioinfo-btg09.wikispaces.com/Lista. El principal motivo que nos ha llevado a centrarnos en este gen es el gran impacto que tiene en el mundo actual la enfermedad de la tuberculosis, y el gran potencial de la proteína codificada por este gen como una posible vacuna contra dicha enfermedad, así como el diagnóstico en personas afectadas.

2.- Descripción
Esta enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis, estimándose que 2 billones de personas están infectados latentemente con ella. Esta bacteria pertenece al grupo bacteriano Actinomiceto, bacterias Gram positivas, con alto contenido en C + G en su ADN. Presentan un crecimiento de forma micelar, pero a diferencia de los Actinomycetos, M. tuberculosis, carece de estadío de espora en su ciclo celular. En concreto, ha sido clasificada como “acid-fast Gram-positive”, debido a la carencia de una membrana celular externa y al alto contenido de lípidos en su membrana plasmática. Por un lado, esta característica probablemente constituya un factor clave en el proceso de virulencia y, por otro, le confiere resistencia frente a condiciones adversas, pudiendo incluso permanecer latente durante años. Además, podemos destacar que M. tuberculosis es un pequeño bacillus aeróbico estricto, presenta un tiempo de generación de 15-20 h (crecimiento extremadamente lento comparado con otras bacterias) y es un patógeno intracelular facultativo que normalmente infecta fagocitos mononucleares.

v Véase referencias a, b, c y 1.

3.- Genoma
Un hito en las investigaciones contra la tuberculosis, tuvo lugar en 1998, cuando se publicó el genoma de M. tuberculosis, H37Rv. El genoma de H37Rv fue secuenciado en el Centro Sanger de Cambridge, en colaboración con el Intituto Pasteur de Paris. El genoma circular de M. tuberculosis presenta una tamaño de 4 millones de pb. El análisis del genoma reveló que el patógeno posee todos los genes necesarios para el metabolismo catabólico y anabólico esencial, conteniendo 3959 genes y 6 pseudogenes. La función del 40% de estos genes ha sido caracterizada, de los cuales 250 genes están implicados en el metabolismo de los ácidos grasos y de éstos, 39 participan en el metabolismo de polikétidos generando la capa serosa, la cual protege a dicha bacteria frente al ataque del sistema inmunológico del huésped. Los genes involucrados en la formación de esta capa se encuentran conservados evolutivamente mostrando la importancia de la capa serosa en la patogenia viral.


Mapa circular del cromosoma de M.tuberculosis, H37Rv

Se han identificado un gran número de proteína secretadas que pueden tener un papel fundamental en el proceso de infección, como fosfolipasas C, lipasas, esterasas y proteasas.

v Véase referencias b,c y 1.


4.- Características del gen Apa
El gen apa está presente en una única copia en el genoma. Dicho gen codifica el complejo antígeno inmunodominante 45/47 KDa de M. tuberculosis. Este antígeno, llamado Antígeno Apa, presenta un alto contenido en prolina (21.7%) y alanina (19%), de ahí su nombre.
La secuencia génica junto con la secuencia upstream está representada por 2061 pb (véase figura 7 de la referencia 2). El análisis de esta secuencia reveló un marco de lectura abierto de 975 pb, con un codón de inicio en la posición 1082 y un codón de terminación en la posición 2056. El marco de lectura abierto codifica para una proteína de 325 aminoácidos, con un péptido señal de 39 aminoácidos, incluyendo un sitio de escisión Ala-Asn-Ala.

v Véase referencia 2.


5.- Características generales y funciones de la proteína Apa
Se ha determinado que las lectinas tipo-C del sistema inmune innato, incluyendo la proteína A surfactante pulmonar humana (PSP-A), juegan un papel importante en el reconocimiento temprano del patógeno y en la respuesta defensiva humana. Diversos estudios han demostrado que el reconocimiento de la lectina tipo-C ManLAM (mannosylated lipoarabinomannan) presente en la superficie del patógeno por PSP-A del huésped no es suficiente para la infección. Por ello se están buscando nuevas moléculas micobacterianas que interactúen con PSP-A humana, centrándose en glicoproteínas de superficie de M. tuberculosis. Estas investigaciones revelaron la existencia de una glicoproteína denominada Apa (alanine and proline rich antigenic).

La glicoproteína Apa sólo ha sido encontrada en el Complejo Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microtti). Sin embargo, Apa no es el único componente de la superficie micobacteriana que tiene como diana el receptor PSP-A humano. Esto se ha comprobado mediante el bloqueo por anticuerpos, resultando en una inhibición parcial de la infección. Además esta hipótesis ha sido apoyada por el hecho de que no existen diferencias significativas en la unión de M. tuberculosis mutante de Apa a la célula huésped con respecto a la unión de M. tuberculosis silvestre.

Estudios de espectrometría de masas revelaron la presencia de residuos de manosa en este tipo de proteínas. La presencia de estos residuos es esencial para la antigenicidad de dichas proteínas en la respuesta inmune dependiente de células T. La capacidad de la proteína Apa para inducir una potente respuesta inmune dependiente de células T y B han llevado a analizar el papel de esta proteína y sus efectos en la infección mediada por M. tuberculosis.

v Véase referencias 3 y 4.


6.- Enfermedad y proceso de infección
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que se transmite por vía aérea y que afecta en la mayoría de los casos a los pulmones, siendo los principales síntomas: tos, a veces con esputo que puede ser sanguinolento, dolor torácico, debilidad, pérdida de peso, fiebre y sudoración nocturna. Actualmente se trata de uno de los mayores problemas de salud, con lo que el entendimiento del mecanismo por el cual M. tuberculosis invade y coloniza su célula huésped es un elemento importante para el control de la infección. La mayoría de los casos activos son consecuencia de la reactivación de infecciones latentes antiguas.

El proceso de infección se inicia con la inhalación de la bacteria en forma de núcleos de gotitas, y se le conoce como tuberculosis primaria. A continuación los bacilos viajan a los pulmones, donde son fagocitados por los macrófagos, desarrollándose la respuesta hipersensible, que forma pequeños nódulos duros conocidos como tubérculos. A partir de esta fase se entra en una etapa de latencia, siendo posible la supervivencia de las bacterias en el interior de los fagosomas de los macrófagos, gracias a la capacidad de M.tuberculosis de resistir a los productos oxidativos, de inhibir el proceso de fusión de los fagosomas con los lisosomas, y de inhibir la difusión de enzimas lisosomales. Al cabo de un periodo de tiempo, el tubérculo puede evolucionar formando lesiones caseosas, las cuales se licuan generando cabernas tuberculosas llenas de aire. A partir de estas cavidades la bacteria se puede diseminar a nuevos focos de infección por todo el cuerpo, lo que recibe el nombre de tuberculosis miliar.


Evolución de la Tuberculosis en el cuerpo humano.

v Véase referencias a y 5.


7.- Aplicaciones Biotecnológicas
La tuberculosis, en la mayoría de los casos, puede curarse con un simple tratamiento con antibióticos; pero la dificultad de un diagnóstico oportuno, los factores socioeconómicos en áreas endémicas y la necesidad de un tratamiento durante meses para erradicar completamente las bacterias del organismo huésped han impedido el éxito del control mundial de esta enfermedad mediante el uso de antibióticos. Además, la aparición de cepas de tuberculosis multirresistente (TB MDR) y extremadamente resistentes a un determinado fármaco (XDR TB) han puesto de manifiesto la importancia de llevar a cabo un mayor esfuerzo contra la tuberculosis.

La vacunación contra esta enfermedad también ha sido sólo parcialmente exitosa, a pesar de que la vacuna actual contra M. tuberculosis, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), es la vacuna más ampliamente utilizada en el mundo, presentando un bajo costo y una gran seguridad. Aunque tiene claros efectos beneficiosos contra la tuberculosis en la infancia, sólo ofrece protección contra la enfermedad para un número limitado de años en regiones endémicas.

Actualmente, el uso del antígeno Apa en vacunas de ADN combinadas con BCG representa una potente estrategia para la prevención de esta enfermedad, a fin de mejorar la eficacia de la vacunación contra M. tuberculosis. La expresión de este antígeno incrementa la respuesta inmune específica antimicobacteriana.

Otra aplicación de este antígeno es la detección mediante anticuerpos del antígeno Apa en el diagnóstico de la tuberculosis.

v Véase referencias 6 y 7.